骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）對(duì)于防止多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞因化療誘導(dǎo)的凋亡至關(guān)重要，但其在他形式細(xì)胞死亡中的作用和機(jī)制尚未得到充分闡明。在這里，我們使用體外BMSC-MM相互作用模型觀察到，BMSCs通過(guò)提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）的水平，保護(hù)MM細(xì)胞免受不穩(wěn)定鐵池（LIP）和活性氧（ROS）觸發(fā)的鐵死亡。從機(jī)制上講，BMSCs的直接相互作用通過(guò)CD40/CD40L信號(hào)通路在MM細(xì)胞中上調(diào)了SUMO特異性蛋白酶3（SENP3）的表達(dá)，并且SENP3在賴氨酸75殘基處解除了SUMO2的共價(jià)連接，從而穩(wěn)定了GPX4蛋白，通過(guò)消耗ROS來(lái)消除Vk*MYC小鼠模型中的MM細(xì)胞以及在Cd40lfl/fl;Prx1Cre/+小鼠（CD40-CKO）和Sumo2敲除（SUMO2-KO）小鼠中分離出的CD138+B220-細(xì)胞的鐵死亡。我們還驗(yàn)證了靶向SENP3增強(qiáng)了GPX4抑制劑RSL3的殺傷效果，從而減少了腫瘤負(fù)擔(dān)，延長(zhǎng)了小鼠的生存期，并減輕了攜帶MM腫瘤的小鼠的骨骼破壞。我們的研究解析了BMSCs防止MM細(xì)胞自發(fā)鐵死亡的機(jī)制，并明確了非凋亡策略在管理難治性或復(fù)發(fā)性MM患者中的治療潛力。本文于2024年12月發(fā)表于“Cancer Lett”（IF=9.1）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）BMSCs上調(diào)GPX4以消除MM細(xì)胞中的鐵死亡

我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，與BMSCs的直接相互作用提高了MM細(xì)胞中的鐵水平，而不穩(wěn)定鐵池（LIP），一種含有氧化還原活性鐵復(fù)合物的池，可以通過(guò)直接產(chǎn)生ROS來(lái)觸發(fā)鐵死亡，但我們沒(méi)有在MM細(xì)胞中檢測(cè)到鐵死亡。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)與BMSCs共培養(yǎng)提高了MM細(xì)胞中LIP的積累（圖1a），然而ROS水平相對(duì)較低（圖1b和c）。因此，我們使用與單克隆抗人CD138抗體結(jié)合的微珠（圖1d）對(duì)BMSCs-MM相互作用系統(tǒng)中的MM細(xì)胞進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并鑒定了387個(gè)差異表達(dá)蛋白（DEP），包括234個(gè)上調(diào)和153個(gè)下調(diào)的蛋白（圖1e）。在所有上調(diào)蛋白中，GPX4和FTH1被列為變化最大的蛋白，以及轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFRC）（圖1f）。有趣的是，KEGG分析顯示，這些DEP在調(diào)節(jié)鐵死亡、礦物質(zhì)吸收、不飽和脂肪酸（UFA）和脂肪酸延長(zhǎng)方面富集（圖1g）。我們驗(yàn)證了GPX4和FTH1的蛋白水平在BMSC相互作用的MM細(xì)胞中都有顯著升高（圖1h）。值得注意的是，對(duì)臨床隊(duì)列GSE4500和GSE9782的分析表明，GPX4的表達(dá)從骨髓漿細(xì)胞（BMPC）階段逐漸增加到單克隆丙種球蛋白病不確定意義（MGUS）和冒煙型多發(fā)性骨髓瘤（SMM）的狀態(tài)（圖1i）。此外，較高的GPX4水平預(yù)示著對(duì)治療的反應(yīng)較差（圖1j），以及GSE4581和GSE9782隊(duì)列中MM患者的臨床結(jié)果較差（圖1k和l）。這些結(jié)果表明，BMSCs上調(diào)GPX4水平以促進(jìn)MM細(xì)胞的存活。

2）SENP3與GPX4相互作用穩(wěn)定GPX4

迄今為止的結(jié)果表明，升高的GPX4是保護(hù)共培養(yǎng)MM細(xì)胞免受鐵死亡的關(guān)鍵因素，然后我們?cè)噲D解碼GPX4上調(diào)的機(jī)制。我們進(jìn)行了免疫沉淀和質(zhì)譜分析，并確定SUMO特異性肽酶3（SENP3）在共培養(yǎng)的MM.1S細(xì)胞中flag標(biāo)記的GPX4蛋白的相互作用組中富集（圖2a），并且在MM細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中檢測(cè)到GPX4和SENP3的共定位（圖2b）。此外，通過(guò)共免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了內(nèi)源性和外源性相互作用（圖2c和d）。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)了SENP3和GPX4之間的直接相互作用（圖2e），其體外直接相互作用通過(guò)GST下拉實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證（圖2f）。同時(shí)，當(dāng)SENP3在MM細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，GPX4蛋白顯著上調(diào)（圖2g），然而敲減SENP3明顯抑制了GPX4水平（圖2h）。為了評(píng)估SENP3對(duì)體內(nèi)GPX4蛋白的影響，我們通過(guò)將Gpx4-floxp小鼠與Cd19-Cre刪除小鼠雜交，構(gòu)建了B細(xì)胞條件性敲除SENP3敲除（CKO）小鼠。正如預(yù)期的那樣，與Senp3fl/fl;WT對(duì)照組相比，Senp3的耗竭明顯抑制了來(lái)自Senp3fl/fl; Cd19-cre小鼠的B細(xì)胞中GPX4蛋白水平（圖2i）。以上所有結(jié)果都表明SENP3通過(guò)直接相互作用穩(wěn)定GPX4。

3）GPX4的降解依賴于SUMO2

由于SENP3調(diào)節(jié)核糖體成熟，我們進(jìn)一步評(píng)估了GPX4蛋白如何在翻譯后進(jìn)行修飾。在SENP3過(guò)表達(dá)（SENP3-OE）的MM細(xì)胞中，GPX4增加（圖3a），而在SENP3敲減（SENP3-KD）的MM細(xì)胞中GPX4減少（圖3b），而SENP3未能改變GPX4的mRNA水平（圖3c）。考慮到SENP3是一種SUMO特異性酶，我們接下來(lái)分析了哪種SUMO分子，包括SUMO1、SUMO2和SUMO3，在GPX4的SUMO化中占主導(dǎo)地位。有趣的是，盡管GPX4可以被所有SUMOs修飾，但與另外兩種相比，SUMO2在修飾GPX4方面更為主導(dǎo)（圖3d）。SUMO2的過(guò)表達(dá)，而不是SUMO1或SUMO3，以劑量依賴性的方式抑制了GPX4水平（圖3e，f，3g）。重要的是，SUMO2對(duì)GXP4的影響可以通過(guò)蛋白酶體抑制劑MG132消除（圖3h）。為了評(píng)估SUMO2對(duì)體內(nèi)GPX4蛋白的影響，我們構(gòu)建了Sumo2敲除小鼠（Sumo2-KO）。正如預(yù)期的那樣，在Sumo2-/- B淋巴細(xì)胞中，GPX4水平顯著升高（圖3i和j）。這些結(jié)果表明SUMO2介導(dǎo)了GPX4的降解。

4）SENP3在K75處使GPX4的SUMO2脫偶聯(lián)

接下來(lái)，我們?cè)噲D探索GPX4蛋白上的SUMO化修飾位點(diǎn)。正如預(yù)期的那樣，在SENP3-KD MM細(xì)胞中，由SUMO2修飾的內(nèi)源性GPX4的SUMO化水平顯著增加（圖4a），而SENP3的過(guò)表達(dá)減輕了由SUMO2修飾的內(nèi)源性GPX4的SUMO化水平（圖4b），并通過(guò)消除SUMO2的共價(jià)結(jié)合來(lái)挽救GPX4的抑制（圖4c和d）。在預(yù)測(cè)GPX4蛋白的氨基酸序列時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)K11、K75、K107、K117和K126殘基是潛在的SUMO化位點(diǎn)（圖4e）。所有這些賴氨酸殘基似乎都可以被SUMO2共價(jià)結(jié)合（圖4f），但只有K75共價(jià)結(jié)合的SUMO2介導(dǎo)的SUMO化對(duì)GPX4蛋白產(chǎn)生了最大的修飾效果（圖4g），證據(jù)表明當(dāng)GXP4蛋白上的第75位賴氨酸突變?yōu)榫彼釙r(shí)，SUMO2的過(guò)表達(dá)無(wú)法降解底物（圖4h）。以上所有結(jié)果表明，SENP3通過(guò)SUMO化修飾從GPX4蛋白的K75位點(diǎn)上解除了SUMO2的共價(jià)結(jié)合，從而穩(wěn)定了GPX4。

5）SENP3與MM的臨床進(jìn)展相關(guān)

在多發(fā)性骨髓瘤（MM）的進(jìn)展過(guò)程中，我們分析了獨(dú)立隊(duì)列GSE9782和GSE2113，并觀察到SENP3的表達(dá)從骨髓漿細(xì)胞（BMPC）階段逐漸增加到單克隆丙種球蛋白病不確定意義（MGUS）和冒煙型多發(fā)性骨髓瘤（SMM）的狀態(tài)（圖5a），在活動(dòng)性多發(fā)性骨髓瘤中甚至更高（圖5b）。我們MM隊(duì)列的臨床樣本進(jìn)一步證實(shí)了SENP3表達(dá)與骨病變數(shù)量之間的正相關(guān)關(guān)系（圖5c）。此外，與初診樣本相比，接受基于硼替佐米方案治療的RRMM患者中分離的CD138+漿細(xì)胞中SENP3和GPX4的蛋白水平都有所增加（圖5d），且這兩種蛋白之間存在顯著的正相關(guān)（圖5e）。值得注意的是，通過(guò)免疫組化（IHC）也發(fā)現(xiàn)了SENP3和GPX4的上調(diào)（圖5f，g，5h）。與對(duì)照相比，SENP3表達(dá)缺陷的MM細(xì)胞對(duì)硼替佐米治療更為敏感（圖5i）。同時(shí)，GSE4581和GSE9782隊(duì)列中MM患者SENP3較高的表達(dá)水平與較差的總生存期相關(guān)（圖5j和k），以及GEO、EGA和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的綜合Kaplan-Meier Plotter分析也顯示這一點(diǎn)（圖5l）。總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明SENP3表達(dá)與臨床上MM的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

6）CD40/CD40L 橋接BMSCs和MM之間的相互作用以調(diào)控SENP3表達(dá)

我們進(jìn)一步建立了體外和體內(nèi)模型來(lái)闡明BMSCs如何調(diào)節(jié)SENP3表達(dá)。在兩個(gè)BMSC-MM相互作用的共培養(yǎng)系統(tǒng)（圖6a）中，僅在細(xì)胞-細(xì)胞接觸條件下，我們觀察到GPX4和SENP3的蛋白水平顯著增加（圖6b），GPX4的SUMO化減少了（圖6c），而GPX4的mRNA水平?jīng)]有檢測(cè)到變化（圖6d）。使用VkMYC小鼠MM模型（圖6e），我們觀察到與來(lái)自外周血或脾臟的細(xì)胞相比，來(lái)自骨髓的CD138+B220-細(xì)胞中GPX4和SENP3的水平明顯更高（圖6f），這表明直接相互作用方式起著決定性作用。接下來(lái)，我們探索了哪種細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)BMSCs和MM細(xì)胞之間的相互作用。根據(jù)之前的報(bào)告，我們分別刪除了MM細(xì)胞上的三個(gè)主要分子，包括VLA-4、MUC1和CD40，并發(fā)現(xiàn)只有CD40的耗竭，而不是VLA-4或MUC1，在細(xì)胞-細(xì)胞接觸模型中未能上調(diào)GPX4或SENP3水平（圖6g），并且BMSCs中CD40-KD未能減少M(fèi)M細(xì)胞中由SUMO2介導(dǎo)的GPX4蛋白的SUMO化（圖6h）。此外，在細(xì)胞-細(xì)胞接觸系統(tǒng)中使用抗CD40中和抗體抵消了BMSC誘導(dǎo)的GPX4和SENP3水平的增加（圖6i），加劇了由SUMO2介導(dǎo)的GPX4的SUMO化（圖6j）。同樣，當(dāng)BMSCs中CD40L耗竭時(shí)，共培養(yǎng)的MM細(xì)胞中GPX4和SENP3水平幾乎沒(méi)有增加（圖6k），GPX4的SUMO化明顯加?。▓D6l）。與Cd40lfl/fl;WT小鼠相比，來(lái)自骨髓的CD138+B220-細(xì)胞中GPX4和SENP3受到顯著抑制（圖6m和n）。這些結(jié)果表明，CD40-CD40L途徑是BMSCs和MM細(xì)胞之間上調(diào)MM細(xì)胞中SENP3的關(guān)鍵橋梁，從而穩(wěn)定GPX4以消耗ROS。

7）SENP3促進(jìn)MM細(xì)胞對(duì)鐵死亡的抵抗

由于GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，我們接下來(lái)討論SENP3在觸發(fā)鐵死亡中的作用。如預(yù)期的那樣，當(dāng)SENP3被耗竭時(shí)，MM細(xì)胞中ROS明顯積累（圖7a和b），并且SENP3的耗竭導(dǎo)致對(duì)GPX4抑制劑的敏感性增加（圖7c），因?yàn)榕c對(duì)照細(xì)胞相比，RSL3顯著誘導(dǎo)了更多的MM細(xì)胞死亡（圖7d）。然而，當(dāng)鐵死亡被鐵螯合劑DFO或鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）阻斷時(shí)，SENP3對(duì)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡的防護(hù)作用被無(wú)效化（圖7e）。為了定義SENP3在體內(nèi)調(diào)節(jié)鐵死亡的作用，我們使用SENP3-KD和對(duì)照MM.1S細(xì)胞構(gòu)建了NSG小鼠基于異種移植和骨髓內(nèi)MM生長(zhǎng)的小鼠模型（圖7f）。在異種移植模型中，當(dāng)SENP3被抑制時(shí)，RSL3表現(xiàn)出顯著的抗MM效果（圖7g），并且SENP3-KD組的小鼠總體生存率顯著延長(zhǎng)（圖7h）；在骨髓內(nèi)小鼠模型中，用RSL3治療的SNEP3-KD細(xì)胞攜帶的小鼠骨髓中的腫瘤負(fù)擔(dān)顯著減少（圖7i），并且骨病變明顯緩解（圖7j），這也通過(guò)骨小梁的三維重建測(cè)量得到了證實(shí)（圖7k），以及包括 BV/TV百分比更高、皮質(zhì)厚度更大、小梁數(shù)量更多以及遠(yuǎn)端和骨干小梁分離尺寸更小的定量分析（圖7l）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明SENP3促進(jìn)了MM細(xì)胞對(duì)鐵死亡的抵抗。

結(jié)論：

骨髓基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)CD40/CD40L信號(hào)通路在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中上調(diào)SENP3，并且SENP3將SUMO2從GPX4的K75位點(diǎn)解離，以穩(wěn)定GPX4，從而防止骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與MM細(xì)胞相互作用導(dǎo)致鐵代謝引發(fā)鐵死亡。我們的研究揭示了SENP3在調(diào)節(jié)鐵死亡中的作用，并為臨床治療復(fù)發(fā)性難治性多發(fā)性骨髓瘤提供了新的治療策略。

實(shí)驗(yàn)方法：

KEGG通路分析、臨床隊(duì)列分析、Kaplan-Meier生存分析、蛋白質(zhì)組學(xué)分析、Real-time PCR、Western Blotting、免疫沉淀和質(zhì)譜分析、GST-pulldown實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)與共培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)、CCK-8實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)、基因敲除與過(guò)表達(dá)、鐵死亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、異種移植模型、骨髓內(nèi)模型、基因敲除小鼠模型、通過(guò)免疫組化

參考文獻(xiàn)：

Jiang H, Li Q, Yang X, Jia L, Cheng H, Wang J, Wang S, Li X, Xie Y, Wang J, Wang Y, Hu M, Guo J, Peng Z, Wang M, Li T, Zhao H, Wang L, Liu Z. Bone marrow stromal cells protect myeloma cells from ferroptosis through GPX4 deSUMOylation. Cancer Lett. 2024 Dec 7;611:217388. doi: 10.1016/j.canlet.2024.217388.